由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測，即PCR到達平臺期后進行檢測，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點產(chǎn)物推算出起始模板量。加入內(nèi)標后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。  內(nèi)標定量：若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標，則PCR反應變?yōu)殡p重PCR，他們之間存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標，也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標，但仍然只是一種半定量的方法。  外標定量：外標法不是把標準物質(zhì)加入到被測樣品中，而是與被測樣品在相同條件下進行檢測。由于在熒光定量PCR中，Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，因此可以利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，并且在PCR循環(huán)剛剛進入真正的指數(shù)擴增期時，Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的，因此定量的結(jié)果也會準確很多。  美國Texas大學的科研人員進行了外標法定量和內(nèi)標法定量的方法學比較，得出的結(jié)論是：內(nèi)標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方法。【Ke LD, Chen Z, Yung WK.A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards. Mol.Cell Probes,2000,14(2):127-135】